我国转基因鱼研制的历史回顾与展望
“转基因”一般是指利用生物技术手段，将一种生物的特定基因，又称目的基因，转移到其他物种中去，改造受体生物的特性，使其在生长速度、抗病抗逆、营养成分、消费品质等方面向人类所需要的目标转变，以获得目的性状优良的新品系[1]。转基因技术随着基因克隆技术的发展应运而生，既可以用于基因的功能研究，又可以用于生物品种的分子改良。相对于传统杂交选育技术，转基因技术是一种快速、定向和精准的育种技术。一方面，转基因技术可将一个或多个目的基因导入受体基因组，极大地提高育种效率；另一方面，转基因技术将突破物种间的生殖隔离，拓展自然种质资源利用的范围，通过种间功能基因的优化组合，实现异源优良性状的整合，创制新的优良性状。
1982年，Palmiter等将大鼠生长激素基因通过显微注射的方法导入到小鼠受精卵内，获得了具有快速生长效应的“超级鼠”[2]。紧随其后，中国科学院水生生物研究所 (简称：水生所) 朱作言等成功研制出首批转基因鱼，部分转基因个体显示出了快速生长效应[3, 4]。作为一种重要的经济动物，鱼的转基因研究因其潜在的巨大应用前景而受到广泛关注，世界上多家实验室相继开展了鱼类基因转移研究。近20年来，中国、美国、加拿大、英国、挪威、日本、韩国等国家广泛开展转基因鱼育种研究，研究对象几乎涵盖所有重要养殖鱼类，研究性状涉及快速生长、高效营养和抗病抗逆。特别在快速生长性状方面，转基因鱼研究取得了一系列重要成果，呈现出巨大的产业前景[5, 6]。最近，美国食品和药物管理局批准了转基因大西洋鲑鱼上市，其成为全球第一例获准进入市场的转基因动物食品[7]，转基因鱼再次成为大众热议的话题。
1 转基因鱼的研究历史 通过遗传物质的操作进行鱼类品种改良的尝试可以追溯到1970年代，甚至更早。20世纪70年代，童第周创立了鱼类核移植研究，将一种鱼的细胞核移植到另一种鱼的去核卵细胞中，培育了“核质”杂交鱼，希望能够用于鱼类的品种改良[8]。然而，由于核移植操作困难，且仅靠细胞质来影响物种的性状，遗传育种效果有限。能不能将一个物种的遗传物质提取出来，直接注射到另一个物种的卵细胞或者受精卵中，引起遗传性状的改变？这是童第周团队成员朱作言的设想，他根据这一设想在水生所进行了鲮鱼Cirrhinus molitorella的总DNA转移以及其后的转基因鱼研究。
鲮鱼是中国广东地区的重要养殖鱼类。鲮鱼喜温，只能在广东南部有限的地区越冬，鲮鱼的抗寒育种研究被列入当时的国家科技攻关计划。有研究者将鲮鱼与习性耐寒的雅罗鱼Leuciscus waleckii杂交，但由于种间的生殖隔离，远源杂交没有成功。1977年春，水生所的研究者们提取了雅罗鱼的总DNA，在广东省兴宁县渔场将其直接导入鲮鱼的受精卵中，以期突破种间生殖隔离，实现外源基因簇的转移与整合。随后将实验鱼运回武汉进行养殖观察，发现11月中旬池塘水温降至6−8 ℃的一周之内，对照鱼全部死亡，但仍有8%左右的转基因实验鱼继续存活了两周，最后一尾死亡时的水温为5 ℃ (朱作言、黄文郁，未发表资料)。限于当时的实验条件，他们没能对转基因实验鲮鱼中的外源DNA片段进行检测。然而，这是第一次“转基因鱼”遗传改良的尝试，实验结果令人鼓舞。
严格地讲，转移总DNA并不完全具备现代转基因技术的特征，它操作的对象并不是一个功能已知、结构完整的基因，总DNA转移的效率和效果都难以把握。显然，具有明确功能的基因元件是转基因研究的重要条件。20世纪80年代初我国尚无基因克隆的条件和技术，朱作言等利用馈赠的重组人生长激素基因 (小鼠重金属螯合蛋白启动子驱动的人生长激素基因)，采用显微注射方法，将该重组基因构建体导入鱼类受精卵，获得第一批转基因鲫鱼、泥鳅和鲤鱼，部分转基因个体表现出明显的快速生长效应[3-4]。随后，对外源基因的整合、表达及世代传递进行了系统的研究。在显微注射的胚胎中，50%以上整合了外源基因，成为转基因鱼。其中约一半左右的转基因个体具有表达外源基因、合成人生长激素的能力。部分外源基因有效整合到生殖细胞中，这部分转基因鱼可以通过有性生殖方式将外源基因传递给子代，后者亦具有表达人生长激素的能力，由此建立起转基因鱼研究模型[9]。
重组人生长激素基因作为外源基因并不适合以育种为目的的转基因鱼研究，一方面，小鼠重金属螯合蛋白启动子元件需要重金属离子的激活，水体中需要维持一定浓度的重金属离子，这样的水体显然不符合商品化养殖的要求；另一方面，携带人生长激素基因的转基因鱼存在潜在的生物伦理问题，可能造成消费者的心理负担。为此，水生所的研究团队分别克隆了鲤鱼β-肌动蛋白基因和草鱼生长激素基因[10]，构建了由鲤鱼β-肌动蛋白基因启动子驱动的草鱼生长激素基因表达载体，这个重组生长激素基因的结构元件分别来自鲤鱼和草鱼，是谓“全鱼”生长激素基因。以黄河鲤受精卵为对象，采用显微注射方法，研制出了快速生长的转“全鱼”生长激素基因鲤鱼——冠鲤[11-12]。
冠鲤中的外源生长激素基因在体内持续高水平表达，不受季节水温变化的调节，血清生长激素含量是对照鲤鱼的2−10倍，维持较高的营养代谢水平[13]；转基因鲤鱼的摄食能量更多地用于生长，代谢和排泄耗能明显少于对照鲤鱼，转基因鲤鱼的生长速度达到对照鱼的2倍，饵料转化效率提高16.8%[14-16]；连续5个世代对外源整合基因的稳定性检测结果显示，转基因鲤鱼基因组中的外源生长激素基因能够稳定遗传[17-18]；冠鲤只需养殖一年即可达到1 kg的上市规格，普通黄河鲤则需要养殖两年甚至更长的时间 (图 1)。冠鲤的诞生为农业动物转基因育种迈出了重要的一步。
图 1 快速生长转基因黄河鲤 (冠鲤)
Figure 1 Fast-growing transgenic Yellow River carp (Champion carp)
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2 我国转基因鱼的现状 近20年来，在国家多项科技计划的支持下，以我国重要淡水和海水养殖鱼类为对象，包括鲤鱼、鲫鱼、草鱼、团头鲂、罗非鱼、黄颡鱼以及大菱鲆和大黄鱼等，进行了一系列转基因育种研究，并取得了重要研究进展[6]。外源基因除生长激素之外，还包括抗病抗逆和鱼肉品质相关基因。
冠鲤的成功研制开启了快速生长转基因鱼的序幕。中国水产科学研究院黑龙江水产研究所利用鲤鱼金属硫蛋白启动子驱动大马哈鱼生长激素基因，通过显微注射方法，培育出转基因黑龙江鲤，其中最大个体的体重超出对照鱼的1倍，外源整合基因可遗传给子代，建立了快速生长转基因黑龙江鲤核心群家系[19-20]，并开展转基因鱼食用与环境安全的各项评价实 验[21-23]。与此同时，转生长激素基因的蓝太阳鱼、黄颡鱼、白鲫等也有相关的文献报道，外源整合的生长激素基因在不同程度上发挥了促生长作用[24-26]。
抗病抗逆和品质改善的转基因鱼研究也取得重要进展。抗病转基因鱼育种主要从两个方面入手，一方面，通过导入免疫相关基因，以提高鱼体的免疫能力，如抗菌肽基因、溶菌酶基因和转铁蛋白基因等。有研究显示，转人转铁蛋白基因的草鱼抗草鱼出血病病毒和柱状黄杆菌感染的能力显著提高[27]；转Mx基因的稀有鮈鲫对草鱼出血病病毒的抵抗力明显提高[28]；转铁调素和抗菌肽的斑马鱼在创伤弧菌和无乳链球菌的感染下存活率明显提高[29]。另一方面，通过干扰和抑制病原体特异基因在鱼体中的表达，提高转基因鱼的抗病能力。例如，针对草鱼出血病病毒VP7基因设计的小发卡RNA表达构建体 (shRNA)，使转基因稀有鮈鲫获得了抗出血病性状[30]。抗逆转基因鱼研究主要针对温度、盐度和溶氧等鱼类生长的胁迫因子。例如，将透明颤菌血红蛋白 (VHb) 基因导入到斑马鱼基因组中，显著提高转基因斑马鱼低溶氧耐受能力[31]。在鱼类品质改良方面，水生所的研究者以斑马鱼作为动物模型，将ω-3长链不饱和脂肪酸合成途经中的两个关键基因 (ω-3去饱和酶fat1和Δ12去饱和酶fat2)，采用转基因技术，获得了富含ω-3长链不饱和脂肪酸的转基因斑马鱼[32]。用同样方法培育的转基因黄河鲤，在肌肉和肝脏中检测到了高丰度ω-3长链不饱和脂肪酸 (未发表资料)。
3 转基因鱼的生物安全 从20世纪90年代开始，转基因产品的生物安全问题就受到社会各界的关注，今天，它仍然是公众的热议话题。转基因产品的生物安全涉及食品安全和生态安全。食品安全是消费者关注的焦点，生态安全则是公众、特别是环保人士的疑虑，这两个安全都是科学家要严肃面对的课题。目前，转基因食品的安全评价主要遵循“实质等同”性原则。就转基因鱼而言，食用转基因黄河鲤与食用普通黄河鲤有什么差别？评价内容涵盖营养学、毒理学、致敏性及结合其他资料进行的综合评价。转基因鱼的生态安全评价主要考虑转基因鱼在自然水体中是否可能破坏原有的种群生态平衡，甚至导致某些野生品种的灭亡，威胁物种的遗传多样性；另一方面，转基因鱼可能与野生近缘种杂交导致“基因逃逸”，造成野生物种的“基因污染”[1, 33-34]。自20世纪90年代开始，我国先后颁布了《基因工程安全管理办法》、《农业基因工程安全管理实施方法》、《农业转基因生物安全管理条例》、《转基因食品卫生管理办法》、《中华人民共和国食品安全法》等各种政策法规，来保障转基因产品的生物安全[35]。
转基因鱼的食品安全评价必须针对携带特定“外源基因”的特定“受体鱼”。以冠鲤为例，它携带的外源基因由两部分组成，鲤鱼的启动子和草鱼的生长激素基因，重组“全鱼”基因的表达产物是草鱼的生长激素蛋白。通俗地讲，吃一条冠鲤就如同在享用黄河鲤的同时还额外获赠了一小碗草鱼汤，基于常识，这对人类的健康不会有任何影响。科学检测的结果证实，摄食转基因鲤鱼对小鼠的生长、血液常规、血生化成分、组织病理和生殖机能及对子一代幼仔的生长和发育均无影响，食用转“全鱼”生长激素基因鲤鱼与食用普通鲤鱼同样安全[36-37]。
评价转基因鱼生态安全的两个关键适合度参数是生存力和繁殖力。对转“全鱼”生长激素基因鲤鱼的生态安全研究发现，快速生长导致其绝对临界游泳速度和相对临界游泳速度的平均值分别比对照鱼要低 22%和24%[38-39]。游泳能力是影响鱼类的食物获取、寻找配偶、逃避被捕食等行为的关键因素，这些因素决定了鱼类在自然环境中生存力。另一方面，通过人工模拟湖泊生态系统，比较了转基因鲤鱼和野生鲤鱼在独立的水生态系统中的繁殖力和后代存活力。结果显示，在自然水体中，转“全鱼”生长激素基因鲤鱼与普通鲤鱼具有相同的繁殖竞争力，但其子代幼鱼存活力低下，即使因为偶然事件逃逸到天然水体中，也不可能形成优势种群，进而威胁鲤鱼自然种群遗传多样性，相反会因为其低下的后代存活力而逐渐消亡[40]。
尽管已有的实验证据表明转基因黄河鲤是低风险的，但这些实验证据在时间和空间尺度上都存在局限性和不确定性。从另一个角度看，转基因鱼的繁殖力是生态安全问题的关键，一个不育的转基因鱼品系将不会对生态系统产生深远影响。中科院水生所与湖南师范大学合作，将转基因二倍体鲤鱼与异源四倍体鲫鲤杂交，通过倍间杂交的方法研制出了转基因三倍体鱼——吉鲤。吉鲤不仅保持了普通三倍体鲤鱼不育的特点，而且比普通三倍体鲤鱼生长快，饵料利用率高 (图 2)[41]。不育的转基因三倍体鲤鱼从根本上规避了转基因鱼潜在的生态风险，其大规模的推广养殖不会对生态系统产生任何负面影响，这可能是加快转基因鱼实现产业化的重要途径。
图 2 不育转基因三倍体鱼 (吉鲤)
Figure 2 Sterile triploid transgenic carp (Auspicious carp).
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4 展望 目前，转基因鱼育种研究主要针对快速生长、抗病抗逆等少数经济性状，经济性状相关基因的发掘是转基因鱼育种研究的根本前提，转基因鱼育种策略的制定同样依赖于对相关功能基因的深刻理解。随着基因组时代的到来，高通量DNA测序技术不断完善，生物信息学日渐成熟，为大规模发掘功能基因、深度解析网络调控机制提供了技术条件。最近，我国重要的经济鱼类如半滑舌鳎、鲤鱼、大黄鱼、草鱼等的基因组测序均已完成，并已完成大量功能基因的注释和基因组框架图的组装[42-46]，这将为鱼类经济性状相关基因的克隆及其调控机制研究提供重要的基础平台。基于这些平台，可望发掘一批鱼类重要经济性状相关基因，揭示其网络调控机制，为广泛开展转基因鱼育种研究奠定基础。
转基因鱼模型研究揭示，外源基因在受体鱼基因组中的整合具有随机性和嵌合性，提高外源基因的整合效率，建立外源基因的定点整合技术是转基因技术发展的关键。转座子和巨核酸酶介导的基因转移方法，能够明显提高基因转移的效率，并已在鱼类转基因工作中广泛应用[47]。最近几年发展起来的TALENs和CRISPR/Cas9技术，使基因组水平上的定点缺失、插入或单碱基突变成为可能[48-49]。有研究报道，TALENs和CRISPR/Cas9技术已经开始应用于鱼类的基因功能研究[50-52]。高效率的外源基因定点整合技术将在鱼类转基因育种研究中发挥重要作用。
三倍体吉鲤模式提供了一种规避转基因鱼生态风险的有效途径，但通过倍间杂交获得不育三倍体只是一个特例，这种策略在其他转基因鱼品系中难以实施。“解铃还须系铃人”，运用转基因技术来解决转基因鱼的育性控制则是一个更具普遍意义的策略。有研究发现，携带反义GnRH基因的转基因鲤鱼，其脑区GnRH基因表达信号明显减弱，一龄转基因鲤鱼血清促性腺激素平均水平显著下降，部分转基因鲤鱼性腺发育被抑制或完全败育[53-54]。进一步的研究发现，利用GAL4/UAS基因表达调控系统和反义RNA技术，研究者在斑马鱼中建立了两个转基因家系，这两个品系的杂交后代丧失生殖能力[55]。随着对鱼类生殖机制和转基
因技术的深入研究，将有望建立一套完备的鱼类育性控制系统，杜绝转基因鱼的生态风险，为转基因鱼的产业化铺平道路。
我们不妨回顾一下重组DNA技术的发展过程，短短的40年成功地开启了一个全新的服务于人类社会生活各个方面的现代生物技术产业。可是，它出现之初所面临的是社会对它的疑虑、恐惧甚至声讨和封杀。从这个角度审视今天转基因技术面临的情况，研究者们感到似曾相识而豪情满怀。从根本上解读转基因育种技术，就是以分子生物学为后盾的精准的物种间“分子杂交育种技术”，是人类育种史上的采集、驯化、选育、杂交发展历程的又一新的更高的发展阶段。这一技术不仅可以服务于育种实践，而且更能够解决传统育种技术所不能解决的育种难题，更好地服务于人类文明社会发展的需要。